局所分化によるオルガノイドの生成とイメージングのための勾配から切片化への CUBE ワークフロー

Communications Biology volume 6、記事番号: 299 (2023) この記事を引用

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オルガノイド培養の進歩により、さまざまな方法で天然の組織を模倣するさまざまな in vitro ミニ臓器が誕生しました。 しかし、体軸パターンを備えた複雑なオルガノイドを生成し、実験後の分析プロセス中にオルガノイドの向きを維持することにはボトルネックが残っています。 ここでは、CUBE 培養デバイスを使用してモルフォゲン勾配でオルガノイドを培養し、続いて CUBE でサンプルを切片化して勾配方向に関する情報を保持するワークフローを紹介します。 我々は、CUBEの反対側の2つの別々の分化培地で培養されたhiPSCスフェロイドが、対照におけるマーカーの均一な分布とは対照的に、それぞれの分化マーカーの局所的な発現をもたらすことを示す。 また、勾配配向情報を保持するために、CUBE で回転楕円体の低温およびパラフィン切片を作成するプロセスについても説明します。 勾配培養から CUBE による切片化までのこのワークフローは、ますます複雑になるオルガノイドを生成し、その発生プロセスを in vitro で研究するための便利なツールを研究者に提供します。

本物の標本は困難な倫理的問題を提起するため、多能性幹細胞 (PSC) とそれに由来するオルガノイドは、人間の発生初期における組織や器官の形成をモデル化して研究するための実用的な方法を提供します 1,2,3,4。 天然組織を模倣するさまざまなオルガノイドを生成するプロトコルは、一般に、異なる時点での Nodal、Hedgehog、Notch、Wnt、または BMP などのシグナル伝達経路の活性化または阻害を連続的に操作して、特定の系統への分化を誘導することに依存しています。腸5、腎臓6、肺7のオルガノイド、胚盤葉上層8,9、ガストルロイド10の生成。

それにもかかわらず、体軸に沿った細胞の成長と分化を制御することは、3D オルガノイド培養において依然として課題です。 in vitro のオルガノイドにおける前方-後方および背側-腹側のパターン形成は、細胞の自己組織化によって生じることもあり、11,12、異なる脳領域をもつ大脳オルガノイドや肝臓、胆管を備えた胆管オルガノイドのように、別々に分化したオルガノイドを集合体として融合させることによっても達成されます。管および膵臓の構成要素13、14。 ただし、これらの方法の限界は、細胞が単一の均一培地で培養されるため、細胞に供給される空間情報に関する制御レベルが非常に低いことです。 オルガノイドを構成する細胞クラスター内のすべての細胞は、培地中のシグナル伝達分子から同じ分化の合図を受け取ります。 一方、生体内では、他の供給源からのモルフォゲンの濃度勾配も、細胞がどこへ行くのか、発生中にどのような表現型やパターンをとるべきなのかを制御するのに貢献します15,16。 例えば、神経管の形成は脊索および非神経外胚葉層からの信号に依存しており 17、腎臓のネフロンは尿管芽と後腎間葉の間でのさまざまな信号の交換によって発達します 18。 したがって、生体内での天然組織によりよく似たオルガノイドを生成するには、モルフォゲン勾配を複製する必要がある。

インビトロでの細胞へのシグナル伝達分子の空間勾配の供給を模倣するために、いくつかの工学技術が開発されている。 ソニック ヘッジホッグ (Shh)19 を発現するように操作された PSC 19 またはモルフォゲンを染み込ませたアガロース ビーズ 20 を、発生中のオルガノイドの近くに配置すると、ソースから分化細胞への分子の拡散により、モルフォゲンの高濃度から低濃度への濃度勾配が形成されます。 さらに、細胞を 2 つの別々の培地コンパートメントで培養できるようにするさまざまな改良トランスウェルやマイクロデバイスも開発され、細胞全体に反対方向のモルフォゲン勾配を生成しています 21、22、23、24、25、26。 しかし、これらの技術には欠点がないわけではありません。(1) 複雑な準備と設定手順が必要であり、専門的なスキルや設備がなければ、ほとんどの生物学ベースの研究室では実行するのが容易ではありません。(2) 装置の配置や位置を制御することができません。 (3) 実験後に、サンプルに大きな損傷を与えたりサンプルの向きを失わずに、さらなる分析のためにサンプルをデバイスから取り出すことは困難です。 特に、細胞が受けた勾配の方向に関する情報を保持できることは、サンプルの適切な分析を確実にするために重要です。